【干货】实验室消毒和灭菌基础知识-实验员务必收藏

消毒和灭菌是微生物实验技术中最基本的操作技术，因此从事药品生产、检验的人员均应了解消毒和灭菌的基本概念，各自的应用方法及其意义，操作时应严格执行相关的操作规程，一方面确保生产与检验工作的效果，另一方面也是对自身安全的保护。

消毒和灭菌的概念

1、消毒：指对病原微生物的繁殖体的致死作用，但不能杀死芽孢等全部微生物，因此消毒是不彻底的，不能代替灭菌。凡用于消毒的化学药品称为消毒剂，因此人们也常称消毒剂为化学消毒剂。

2、灭菌：杀灭物体中所有活的微生物（含芽孢）的作用，灭菌是采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。通常用物理方法来达到灭菌的目的。

消毒灭菌方法

目前常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等)和化学方法(消毒剂、抗生素)两大类。

1.干热灭菌法
干热灭菌法是利用恒温干燥箱内120ºC~150ºC的高热，并保持90~120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法。

主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。

用此方法灭菌的物品干燥，易于贮存。

酒精灯火焰烧灼灭菌法也是属于干热灭菌的方法之一。在进行动物细胞体外培养工作时，常须利用工作台面上的酒精灯火焰对金属器具及玻璃器皿口缘进行补充灭菌。 

2.湿热灭菌法

压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。

它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。

适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。高压蒸汽灭菌器的蒸汽压力一般调整为1.0～1.1kg/cm²，维持20～30min即可达到灭菌效果。

3.射线灭菌法

利用紫外线灯进行照射灭菌的方法。

紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通过对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活。

适合于实验室空气、地面、操作台面灭菌。灭菌时间为30min。用紫外线杀菌时应注意，不能边照射边进行实验操作，因为紫外线不仅对人体皮肤有伤害，而且对培养物及一些试剂等也会产生不良影响。

4.过滤除菌法

过滤除菌法是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。

过滤除菌法大多用于遇热易发生分解、变性而失效的试剂、酶液、血清、培养液等。

目前，常用微孔滤膜金属滤器或塑料滤器正压过滤除菌，或用玻璃细菌滤器、滤球负压过滤除菌。滤膜孔径应在0.22～0.45μm范围内或用更小的细菌滤膜，溶液通过滤膜后，细菌和孢子等因大于滤膜孔径而被阻，并利用滤膜的吸附作用，阻制小于滤膜孔径的细菌透过。

5.化学消毒剂消毒法

化学消毒剂消毒法用于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作面、操作者皮肤、某些实验器皿等。

1）消毒剂分类

依杀灭微生物能力进行分类，有以下三种：

2）消毒剂的选择

消毒剂的种类很多，性质不一，因此应根据实际需求选择既安全又有效的消毒剂。在选择时至少应考虑以下几点：

3）消毒剂的使用

A、影响消毒效果的因素

影响消毒剂效能的因素比较复杂，一般都因消毒剂的种类而异，因此各种消毒剂使用时应注意以下因素

a）微生物种类及数量

消毒剂的有效浓度及作用时间因微生物的种类及数量的不同而有差异，不同类型的病原微生物对消毒剂的抗力不同。对于细菌繁殖体来说，革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌对消毒剂的耐受性强，尤其是铜绿假单胞菌的耐受性较强；芽孢的耐受力最强，在化学消毒剂中，戊二醛和过氧乙酸可杀灭芽孢，但其作用力不如热力灭菌方法；病毒对消毒因子的耐力也因其种类的不同而有相当大的差异，亲水病毒的耐力较亲脂病毒要强；真菌对大多数化学药物的耐受力较强，因此适用于细菌的消毒剂并不一定适用于真菌，但真菌一般耐热性较差。微生物污染数量多时，应加长消毒接触时间、加大消毒剂用量或提高消毒剂浓度。

b）温度

一般来说，消毒的速度随温度的提高而加快，其杀菌作用也相应增强。温度影响的原理是其可影响菌体表面和酶系统的活性，以及消毒剂的分子运动，使得消毒剂与菌细胞接触的机会增加，从而使消毒的时间缩短。但温度的变化对各种消毒剂的影响不同，如醇类和酚类一般受温度影响较小，但如甲醛、环氧乙烷等温度升高一倍时，其杀菌效果可增加十倍。

c）浓度

消毒剂的浓度应考虑的是其主要成分的浓度，根据不同类型的消毒剂性质，提高或降低浓度，均可显著影响消毒效果。一般降低消毒剂的浓度需延长相应的消毒时间，且消毒剂内的有效成分在其保存期内也会相应下降。

d）pH值

酸碱度常影响酸性或碱性消毒剂的电离度，改变其溶解度及分子结构，影响不同离子型消毒剂的作用，在碱性环境中，细菌表面负电荷增多，阳离子型消毒剂作用较强，在酸性环境中，细菌表面负电荷减少，阴离子型消毒剂的杀菌效果较好；另外pH的过高或过低对微生物的生长及表面物理化学状态均有影响。

e）有机物质

消毒环境中存在有机物，则其可在微生物表面形成保护层阻碍消毒剂与微生物的接触或延迟消毒剂的作用，可能导致微生物逐渐产生对药物的适应性，这些情况均会不同程度的降低消毒剂的消毒作用，如有机物可中和一部分消毒剂，有机物和消毒剂作用，形成溶解度比原来更低或杀菌作用比原来更弱的化合物。一般来说消毒剂中的重金属类及表面活化剂等受有机物的影响较大。

B、其他注意点

a）微生物对消毒剂的耐受性

一般来说，为了避免微生物对消毒剂的耐受性，很多企业的消毒剂是轮换使用的，现今在学术界对于消毒剂的轮换使用的必要性尚存争议，但FDA的监管引文中主导应进行消毒剂轮换，但消毒剂的轮换使用周期应以历史环境监测数据为基础制订。微生物对消毒剂的耐受性较抗生素要低一些，因为消毒剂比抗生素有更强的杀菌作用。另外使用高浓度的消毒剂来杀灭少量的微生物通常影响不大，因此应考虑选择合适的消毒剂来对抗不断增强的耐受性。同时建议定期进行试验证明或评估从环境菌监测中分离出的微生物（含已知及新的类型）对该环境使用消毒剂的敏感性。

b）规范及安全使用

在消毒剂的使用过程中，人员培训及是否规范及安全使用该消毒剂对其应用有很大影响。接触消毒剂的人员要求进行微生物、清洁灭菌操作、消毒剂的制备/使用/安全处理废弃稀释及浓缩消毒剂的培训。如正确配制消毒剂是关键，很多消毒效果不佳或失败的例子源于消毒剂的过度稀释，另外用于无菌操作流程的消毒剂必须用无菌水稀释，一般稀释用水推荐纯化水及更高级别的水，因为水的硬度会影响一些消毒剂的功效。另外在处理可能产生有毒刺激性气体、腐蚀性较强及浓度较大的消毒剂（如杀孢子剂）时，应配备适宜的安全防护装备，如安全眼镜、面罩、过滤气味的口罩、手套、防护服等。在消毒剂的使用同时应考虑清洁剂的配合使用，清洁是去除表面颗粒及微生物、去除残留并提高后续消毒效果，因此清洁是为后续的消毒做好准备，同时规避前后2种轮换消毒剂的互相作用。

6.抗生素抑菌法

抗生素抑菌法主要用于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、链霉素和新霉素等。

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