高效液相色谱仪常用检测器及其性能

液相色谱检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。

1、紫外吸收检测器

紫外吸收(UV)检测器是目前HPLC应用最广泛的检测器。其工作原理是朗伯-比尔定律。这种检测器灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱分离。紫外吸收检测要求被检测样品组分有紫外-可见光吸收，而使用的流动相无吸收，或在被测组分吸收波长处无吸收。一般选择在欲分析物有最大吸收的波长处进行检测，以获得最大灵敏度和抗干扰能力。在没有最大吸收时，可采用末端吸收。检测波长的选择除取决于待测物质的成分和分子结构外，还必须考虑流动相组成、共存组分干扰等因素。特别是各种溶剂都有一定的透过波长下限值，超过这个波长，溶剂的吸收会变得很强，以至于不能很好地测出待测物质的吸收强度。下表列出了HPLC中一些常用的溶剂透过波长的下限。

2、光电二极管阵列检测器

光电二极管阵列检测器（photodiode array detector，PDAD）又称快速扫描紫外可见分光度计，是一种新型的光吸收检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件，形成多通道并行工作,同时它对光栅分离的所有波长的光信号进行检测，然后将其入射到阵列接收机，然后快速扫描二极管阵列来采集数据,得到吸收值(A)是保留时间(tR)和波长(L)函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。计算机化的数据处理，还可进行色谱峰光谱相似性比较、峰纯度检测及利用谱图库对样品进行检索等，为定性、定量分析提供更丰富的信息。

单光束二极管阵列检测器，光源发出的光先通过检测池，透射光由全息光栅色散成多色光，射到阵列元件上，使所有波长的光在接收器上同时被检测。阵列式接收器上的光信号用电子学的方法快速扫描提取出来，每幅图像仅需要10 ms，远远超过色谱流出峰的速度，因此可随峰扫描。

3、荧光检测器

荧光检测器（fluorescence detector， FD）是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能产生荧光的化合物。荧光检测器的原理与荧光分析法相同，化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光或发射光。许多药物和生命活性物质具有天然荧光,能直接检测，某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，然后进行荧光检测。其最小检测浓度可达0.1 ng／mL，适用于痕量分析。一般情况下，荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级，但其线性范围不如紫外检测器宽。近年来，采用激光作为荧光检测器的光源而产生的激光诱导荧光检测器极大地增强了荧光检测的信噪比，因而具有很高的灵敏度，在痕量和超痕量分析中得到广泛应用。 

4、示差折光检测器

示差折光检测器（differential refractive Index detector， RID）是一种通用的浓度检测器，对所有溶质都有响应。某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差检测器检测。示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高。在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。

5、电化学检测器

电化学检测器（electrochemical detector， ECD）属选择性检测器，主要有电导检测器、安培检测器、介电常数检测器和电位测定检测器等，可检测具有电活性的化合物。电导、电位等检测器已在离子色谱中得到了广泛应用；介电常数检测器性能类似于示差折光检测器；安培检测器可检测氧化性物质，适用范围很宽。

电化学探测器的优点：

①灵敏度高，检测量一般为ng级，可以达到pg级。

②选择性好，可测定大量非电活性物质中极痕量电活性物质；

③线性范围宽，通常为4～5个数量级；

④设备简单，成本较低；

⑤易于自动操作。 

6、化学发光检测器

化学发光检测器（Chemiluminescence detector， CD）是近年来发展起来的一种快速、灵敏的新型检测器，具有设备简单、价格低廉、线性范围宽等优点。其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势反应中间体或反应产物，当它们从激发态返回基态时，就发射出光子。由于物质激发态的能量是来自化学反应，故叫作化学发光。当分离组分从色谱柱中洗脱出来后，立即与适当的化学发光试剂混合，引起化学反应，导致发光物质产生辐射，其光强度与该物质的浓度成正比。

这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要有恒流泵，将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱流出物迅速而又均匀地混合产生化学发光，通过光电倍增管将光信号变成电信号，就可进行检测。这种检测器的最小检出量可达10～12g。 

7、蒸发光散射检测器

蒸发光散射检测器(evaporative light—scattering detector，ELSD)是20世纪90年代出现的新型通用型质量检测器，它适用于检测挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等，并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物。对各物质有几乎相同的响应，但是其灵敏度比较低，尤其是有紫外吸收的组分。此外流动相必须是挥发性的，不能含有缓冲盐等。它的通用检测原理克服了常见于HPLC传统检测方法的不足，已越来越多地应用于HPLC、超临界色谱和逆流色谱中。不同于紫外和荧光检测器，ELSD的响应不依赖与样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合与梯度洗脱液相色谱联用。

（1）ELSD检测原理

ELSD运行有三个过程：第一是雾化过程，用惰性气体或净化空气将色谱柱流出物雾化；第二是蒸发过程，在一个加热管(漂移管)中将流动相挥发；第三是检测过程，测定留下来的样品颗粒的光散射。所有商品ELSD都由一种或两种模式完成这三个过程。模式A的操作是全部柱流出物(气溶胶)都进入直的漂移管，让流动相在其中蒸发，模式B中是将气溶胶通过一个弯管，在此管中大的颗粒沉积下来流入废气管，其余的小颗粒进入螺旋状的漂移管，在上述两种模式中，样品颗粒均进入光管，使激光发生散射而得以检测。

（2）ELSD检测的优点及缺点

优点：

①具有较好的通用性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测；

②在相同色谱条件下，物理性质相似的物质可给出一致的响应；

③能与梯度洗脱方式相容;

④灵敏度高于示差折光检测器、紫外末端吸收检测法。

⑤在ELSD上开发的实验方法移植到质谱上则无需修改。

ELSD检测的不足之处主要是：

①灵敏度不够理想；

②流动相的选择受限；

③某些样品线性范围较窄等。

（3）影响ELSD检测性能的基本因素

①操作模式选择，选择合适的操作模式可提高方法的灵敏度，操作模式的选择取决于样品的挥发性、流动相的组成及其流速。

②流动相组成及流速选择，流动相的挥发性越好，方法的灵敏度越高。流动相的流速越低，相应的信号越强。

③漂移管温度对基线水平和噪音的影响并无明显规律性。最优温度应为在流动相基本挥发基础上，产生可接受噪音的最低温度。

④载气流速是影响检测性能的一个很重要因素。最优载气流速应是在可接受噪音的基础上(例如0.5mV)，产生最大检测响应值时的最低流速。

（4）ELSD检测时的数据处理模式

ELSD检测最常采用的数学模型是lgy=algx+b (y为响应值，x为进样量或样品浓度，a、b为回归常数)，也有采用二次曲线模型的(y=ax2+bx+c)。由于响应值(y)与进样量(x)之间并非线性关系，故其数据处理不同于紫外检测方法。ELSD测定已知物质的含量时，一般应用随行标准曲线法而非外标法，因为校正线性方程的截距并不为零。新药基准品的建立，除了对照品为另外一种含量已知、结构相似的物质外，数据处理方式同上相似。ELSD测定物质纯度时，由于响应值与进样量间并非线性关系，多通过绘制其中的一种或数种物质的随行标准曲线来加以校正。多组分物质的分析，除了随行校正曲线的线性范围有所区别外，数据处理同上类似。尽管存在一些不足之处，但是ELSD作为一种新型的通用型质量检测器，具有许多独特的优势，例如它的通用性，响应因子的一致性以及与梯度洗脱相容等，将在无特征紫外吸收物质的分析方面发挥越来越重要的作用。

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