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我经常开玩笑说,要保护色谱柱以得到最长寿命的方法就是不要开封色谱柱。一旦开始使用,色谱柱的寿命就逐渐衰减一直到用坏为止。而影响色谱柱寿命的两个主要因素是样品中的杂质和颗粒,因此如果我们能够在进样前去除样品中的杂质和颗粒,色谱柱的寿命一定会延长。
前处理的方法包括固相萃取(SPE),液液萃取和其他的过滤方法。简单地说,如果在样品进入色谱柱前能大量减少其中的污染物,色谱柱的寿命一定会延长,但是同时我们也必须考虑花在前处理的时间和费用是否能得到合理的回报。如果目前使用的色谱柱已经达到500针的进样量,而使用前处理所增加的时间和费用,如果需要将色谱柱的寿命由进样500针增加到2500针才划得来的话,就必须好好考虑是否前处理有其经济效益。但是如果进血浆样品,不经过前处理,可能不到10针柱子就废了,这时候前处理就非常有必要了。但是除了经济效益以外,对于使不使用前处理,对色谱数据的优劣也必须做一个比较。在我们实验室中,这些前处理往往能够让我们即使在更低的浓度下也能收集到有效的数据,也能让我们得到更一致的结果。
不管有没有使用前处理,建议所有的样品在进样前经过过滤或是离心处理。例如当样品经过滤膜可以滤除颗粒从而减少堵塞色谱柱的筛板,滤膜的孔隙大小必须小于色谱柱的筛板孔径大小。一般大于3 μm颗粒的色谱柱使用2 μm大小的筛板,3 μm颗粒的色谱柱则使用0.5 μm的筛板,而小于3 μm颗粒的色谱柱一般使用0.2 μm的筛板,因此最通用的0.45 μm的滤膜基本可以用在除了亚2 μm颗粒以外所有的色谱柱;对于亚2 μm颗粒的色谱柱,一般使用0.2 μm大小孔隙的滤膜。大多滤膜是事先封装好,可以直接接在注射器进行过滤或是作为96孔板的过滤板。
虽然使用滤膜是有效果,但是建议首先考量以下四点:
(1)滤膜并不便宜,虽然每一片的单价并不是很贵,但是加起来的费用就不便宜了;
(2)过滤会花费额外的时间,使用0.5 μm滤膜过滤很慢,而使用0.2 μm滤膜就更慢了;
(3)严格地讲,一旦过滤一个样品,对其他样品,不管有没有必要过滤,都得过滤,以免出现不必要的变量干扰实验数据;
(4)一旦使用过滤,对方法开发进行验证时,也必须验证过滤程序。由于过滤过程往往会损失样品,因此我们需要确定是否存在不同成分损失程度不一致的情况,特别在高浓度和低浓度的时候。
由于使用滤膜是费时费钱的工作,因此每个实验室要先做评估是否值得。但是不可否认,使用滤膜过滤样品在绝大多数的情形下是可以增长色谱柱的寿命。
另外可以取代或是补充滤膜过滤的方法就是进样前使用离心处理样品。这是简单又经济的方法。离心后,一些容易堵塞筛板的大颗粒会沉淀在离心管底部,然后可以很简单取样进行分析。多年来我们一直使用这种方法在蛋白样品的分析,几乎没有发生过因为颗粒堵塞色谱柱的问题。我曾经有过在使用UHPLC时,虽然样品经过0.2 μm的滤膜过滤但是还是有些浑浊,进这种样品而造成色谱柱堵塞的经历,但是一旦浑浊的样品经过离心后,取不再浑浊的样品进样,色谱柱堵塞的问题也解决了。
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