1、首先将高压蒸汽灭菌锅内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜；

2、放回灭菌桶，并装入待灭菌物品，注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果，三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞；

3、加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气；

4、高压蒸汽灭菌锅用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间，本实验用1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟灭菌；

5、高压蒸汽灭菌锅灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品，如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染；

6、将高压蒸汽灭菌锅取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

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