(一)实体显微镜(Stereomicroscopy;解剖显微镜):解剖显微镜主要是用来观察不透明的物体或生物标本外部形态,或在工业和部分生物医学技术 上。此种显微镜受光源、景深和其他成像因子的影响,放大倍率在60倍以下,解像效果较佳。
(二)光学显微镜(Light microscopy) :一般简称为LM,二组透镜及显微镜机械本体组成,主要是用来观察生物体的器官组织结构或生物细胞的内部构造。此种显微镜的二组透镜,一组是接近观察之标本的透镜称为接物镜或简称为物镜,另一组是靠近眼睛称为接目镜或简称目镜。物镜位于物体标本上方而由上往下观察者为正立光学显微镜;物镜位于物体标本下方而由下往上观察者为倒立光学显微镜。一般所观察的呈像方式为明视野,但因所要观察物特性或欲呈像之不同,有特别的附属呈像系统。
1. 明视野(bright field):最基本的观察模式,主要是用来观察透或近乎透明的材料(物体或生物标本)。此种显微镜观察用的材料,除较简单的低等生物(如细菌、真菌和大部分藻类等等)外,大都需用经过事 先的处理和切成薄片,制作成临时或永久切片后,才可以在显微镜下观察。普通光学显微镜使用的光源可穿透标本,故常用于观察生物体
的器官组织结构或生物细胞的内部构造。
2.暗视野(dark field):可将要件架设于明视野显微镜之主体上,利用一个不透光的滤片遮掉聚光镜上大部分的光线,仅聚光镜边缘的光线可以通过,结果使整个视野变暗,而标本物体的轮廓变亮,适合用于观察小而薄、近乎透明或纤细的构造,如细菌或鞭毛或用于微小个体计数。
3. 相位差(phase contrast):可将要件架设于明视野显微镜之主体上,利用光波通过标本物体时,速度会被减缓或加速而与通过封片介质之光 波产生“out of phase”的现象,造成光波互相干扰形成明暗对比,用以 观察透明无色的物体。此类显微镜之聚光镜有一phase ring,物镜内有一phase plate(镜头外刻有Ph字样)。当光线通过标本时光波行进速 度受影响,而与其他光线产生约90度的out of phase,再利用物镜内之 phase plate加强干扰作用,使通过物体边缘的光加速,而与通过物体的光成180度的out of phase,形成破坏性干扰(destructive interference) 使物体影像变暗,但具有明亮之轮廓。
4.微分干涉差(differential interference contrast, DIC;Nomaski):可将要件架设于明视野显微镜之主体上,原理与位相差显微镜类似,但可用于观察较厚的标本,同时可观察到3-D影像。首先利用偏光镜将所有的 光波转成在同一平面(方向)振动,在利用棱镜(beam splitter)将半 数的光波转成90度,当光通过标本时,标本的化学结构会使某一方向的光波波长较另一方向之光波短。在利用物镜(此类物镜外刻有DIC 字样)上方的棱镜(beam analyzer)将光拉回成束,造成光波波长差异形成干扰,使影像各部位呈现不同颜色,而使影像产生立体感。
5. 荧光(fluorescence):以波长较短的紫外光为光源,解像力较佳,同时利用紫外光射在荧光物质上会激发出可见光的特性,适合用于特定对象之鉴别与定位。如以荧光物质(如calcofluor)或以抗体结合荧光物 质(如FITC),可用于标定特定对象在组织内的位置,此即荧光显微 镜技术。该设备昂贵、操作复杂、标本准备费时为其缺点,但结果的高度专一性与准确性则非他种显微镜可取代。
(三)雷射扫描共轭焦显微镜(Radial Scanning Confocal Microscopy) :共轭焦显微镜所看到的影像只是一个极小的亮点,而不是如传统显微镜所看到 的二维空间影像;利用共轭焦显微镜内建的扫描器,可将影像由很多点组 成线,很多线组成面,取得由点厚度所组成的单一平面影像称为光切片 (optical sections)。光切片配合电脑辅助运算处理,可呈现出兼具高解析度明视野(左)及荧光处理(右)于显微镜之观察利用抗体结合荧光物质后,抗体会与特定标本细胞表面之抗原结合 (左),在荧光显微镜下即可观察到发出荧光的特定标本(右)。和低背景杂讯的二维空间相片;或将多张同平面不同荧光探针的相片重 叠,可研究其相对部位的关系;或由一系列不同平面的相片,可组合成三 维空间的立体影像;再加入时间因子,可创造出动态的4D 影像。
(四)电子显微镜:电子显微镜(Electron microscopy),一般简称为 EM,依成像的过程和构造的复杂性,可分为扫描式和穿透式电子显微镜等二大类。 利用电子显微镜观察之标本实必需经特殊步骤处理后,方可观察。另外,还有扫描式原子探测显微镜,目前应用于观察原子或分子的形状。 由于这些设备昂贵,皆属于国家贵重仪器,且技术性高,需有专人处理。
1. 穿透式电子显微镜(TEM): 以电子枪(electron gun)发射之电子束 (electron beam)为光源,由于该波长极短,可以直接穿透 0.2 μm的标本,使影像在 photographic plate上呈现 2-D 的结构。
2. 扫描式电子显微镜(SEM): 以电子枪(electron gun)发射之一次电子束 (称 primary electron beam)为光源,该波长极短,再照 射在样品标本 表面(通常外表镀金)后,会激发二次电子束(secondary electron beam) 反射,使影像为电子接收器接收,经一连串影像放大后,会在荧幕上呈 现 3-D 的物体外表影像结构。
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