荧光显微镜里看的啥？

我们在明场光下做生物组织的形态观察、组织化学成分研究用的是白光光源穿透薄片样品来收集图像，这是最基础的光学成像模式，也是教科书上Robert Hooke第一次观察到植物细胞继而以cell命名细胞时所用的观察方式。

如果明场成像是白天模式，那么荧光成像则是黑夜模式，而且它还能做更多的亚细胞研究，黑夜模式下我们要寻找的荧光就是黑夜里的星星和月亮。在荧光显微镜里看的是荧光样品被特定激发光照射之后受激发射而来的可见光，这些可见的荧光反射回到光路里最终被我们观测到。今天我们就来聊一聊如何准确地在黑夜里找到我们想找的星星和月亮。先摆个荧光显微镜的光路图给大家瞄一眼，高手请自动过滤，新手请研习。最怕新手在实验室里看着荧光图像时狂调明场光聚光镜并告诉我调聚光镜如何有效云云...三两下过后姐就得重新做个科勒照明，不然后面要拍明场图像的同学就悲催了。

言归正传，想知道如何准确找出样品里的荧光，我们还得从光谱的角度认识这些能被检测到的荧光的性质。

正如上图所示，电磁波谱覆盖范围根据波长从短到长依次从宇宙射线、X光、紫外光、可见光、红外光、雷达、无线电波、广播波段，而我们在显微成像中说的光谱是指图中放大部分从近紫外到近红外波段，在电磁波谱里面波长越短能量就越强，所以当我们用连续光（脉冲激发光那些以后再聊）激发样品时都是用短波长的激发光去激发样品发射出长波长的可见光。正如图中放大区域所示，我们在荧光显微镜里面能观测到的可见光波段包含了蓝紫、蓝、青、绿、黄、橙、红、深红等颜色的光，它们的能量依次递减。

我们在荧光显微镜中观测到的荧光是如何产生的呢？

当荧光样品受到激发光照射接收足够能量便能从稳定的基态跃迁到激发态，激发态非常不稳定势必要回归基态，荧光样品通过发出荧光的方式释放能量回归基态。用于荧光显微观察的荧光样品必须具备这种特点，然而许多样品里能受激发荧光的物质不是永恒存在，所以会出现荧光观察过程中越来越暗的情况，这种现象我们称之为“荧光淬灭”（制样的过程选择含有抗淬灭剂的封片剂可减缓荧光淬灭）。

在荧光显微镜的硬件里依靠滤光片组合为我们做光的筛选。以下图以GFP绿色滤光片组为例进行详细说明：左侧光源是由金属卤化物灯或汞灯带给我们近紫外到近红色的激发光，通过蓝色滤光片仅让蓝色光通过到达斜着放的二向色镜反射到达样品，样品接收蓝色光激发发射出比蓝色光波长更长的绿色荧光等，反射出来的荧光仅有绿色荧光能穿透二向色镜最终穿透中最上方的绿色滤光片再次过滤到达目镜，至此我们才能在目镜里看到相对准确的绿色荧光信号。

使用某台荧光显微镜前，最好确认机身所含的荧光滤光片组合是否能匹配样品所带的荧光，例如一台标配三色荧光的显微镜（蓝DAPI、绿GFP、红Rohd）就没法给我们完美地呈现青色荧光或黄色荧光的图像。滤光片组是一台荧光显微镜检测范围的一个很重要的因素，选择合适的滤光片组才能让我们准确找到所要观察的星星和月亮，所以千万不能忽略了它们哟！

聊了一些硬件的原理，咱们放松一下欣赏几张荧光图片。

上图是在荧光体式显微镜所拍的带GFP标记的斑马鱼幼苗（这是一条活鱼，至于为啥能让它乖乖呆着不动，是因为我们把它放在了琼脂糖凝胶里。在0.1M的琼脂糖凝胶里斑马鱼宝贝们依然能够正常呼吸活好几天，我们除了对它的组织结构进行观察之外若经过特殊处理后我们还能利用更多高端显微镜轻松观察到例如血液流动，表皮色素形成，神经生长之类的动态变化过程。

上图是荧光显微镜所拍的拟南芥原生质体的明场成像与荧光成像，两种成像模式结合起来能给我们提供更多信息，比如上图中我们能在明场模式下确定原生质体是否完整。这里的荧光图片也是同学们常和我提起的问题--用红色荧光滤光片组合无法区分mcherry与叶绿体的红色自发荧光（以后另写推文分享解决这个问题的若干方法）。

上图是做了细胞核（蓝色）和两种微管蛋白（绿色、红色）和三色荧光叠加的图片。这里要和大家分享一下，如果染了微管或者微丝的荧光，记得用高倍物镜来成像哦，低倍镜的数值孔径较低，分辨能力差，很可能看到一团糊的荧光，一般我都推荐至少用40倍或更高倍数的物镜来观察。

PS：小伙伴们设计实验特别是制样前购买荧光染料或构建荧光载体时需要充分考虑荧光的波长，选择和自己实验室荧光显微镜滤光片组匹配的染料，多色荧光成像还需考虑荧光和荧光之间在光谱上面不要太过接近，避免荧光串色，傻傻分不清，最后实验白做！

还有更多关于荧光显微镜的问题，欢迎联系集思，我们将为您提供优质的服务。

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