早在古罗马时期，人们就已经知道将一滴包含混合色素的溶液滴在一块布或一片纸上，通过观察溶液展开的同心圆环来分析染料和色素。这就是最古老的液相色谱分离技术。

二十世纪初期，俄国植物学家茨维特（Tsweet）在1906年发表的关于色谱的论文中写到：将一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，然后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，他把这些色带称之为“色谱图”（Chromatogram）。遗憾的是，在随后的二十年内这一新的分析技术都没有得到科学界的注意和重视。

直到1931年，库恩（Kohn）报道了他们关于胡萝卜素的分离方法时，色谱法才引起了科学界的广泛注意。

1941年，马丁（Matin）和辛格（Synge）用一根装满硅胶微粒的色谱柱，成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的分离，建立了液液分配色谱方法，他们也因此获得了1952年诺贝尔化学奖。1944年，康斯坦因（Consden）和马丁（Matin）建立了纸色谱法。1949年，马丁建立了色谱保留值与热力学常数之间的基本关系式，奠定了物化色谱的基础。1952年，马丁和辛格创立了气液色谱法，成功地分离了脂肪酸和脂肪胺系列，并对此法的理论与实验做了精辟的论述，建立了塔板理论。1956年，斯达（Stall）建立了薄层色谱法。同年，范·底姆特（Van Deemter）提出了色谱理论方程；后来吉丁斯（Giddings）对此方程作了进一步改进，并提出了折合参数的概念。这一系列色谱技术和理论的发展都为HPLC的问世打下了扎实的基础。

1960年代早期，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，分析化学家们把目光转向了液相色谱。液相色谱也的确从蛋白质中分离出了纯的化合物，但使用液相色谱又出现了一个新的问题：分离时间相当长。当时所使用的色谱柱效率非常低，具有代表性的柱子是一米来长或更长，为了获得必要的分辨率，有时还得使用多根柱，液体流动的产生靠重力，其流动速度是每小时几毫升或更少，无计算机自动操作仪器和进行数据收集。当时的生物学工作者往往要经过好几年的努力才能从一个组织中把蛋白质完全分离出来。

在仪器发展方面，HPLC的第一个雏形是由斯坦因（Stein）和莫尔（Moore）于1958年发展起来的氨基酸分析仪（AAA），这种仪器能够进行自动分离和蛋白质水解产物的分析。在六十年代早期的相关进展是莫尔（Moore）发展起来的凝胶渗透色谱（GPC）。不久以后，沃特世（Waters）有限公司制造了商业GPC仪，这种仪器经过微小的改进之后可用于HPLC分离。

1968～1971年间，第一台普遍适用的HPLC商用系统被推出。这种新的色谱仪是由科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath）、莆黑斯（Preiss）和里普斯克（Lipsky）等人研制发明的。从此，开启了高效液相色谱的时代，也成之为现代液相色谱。

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